اختراع حاضر مربوط به روشي براي خالص‌سازي و تهيه پادزهر به جهت مصارف درماني در موارد مسموميت با زهر گونه‌هاي سمي است. اين روش مي‌تواند براي تهيه پادزهر منووالان يا پلي‌والان بسته به موارد مصرف و راهبرد توليد استفاده شود. آنتي‌بادي‌هاي ضد سم موجود در پلاسما (IgG)، پس از طي مراحل كدروت‌زدايي، هضم آنزيمي، رسوب ناخالصي‌ها با استفاده از كاپريليك اسيد، كدورت‌زدايي، اولترافيلتراسيون/ ديافيلتراسيون و نانوفيلتراسيون خالص‌سازي مي‌شوند. اين اختراع، روشي كوتاه، ساده و ارزان براي توليد پادزهر است، به طوري كه محصول توليد شده داراي خلوص، ايمني و خاصيت خنثي‌كنندگي منطبق بر استانداردهاي فارماكوپه و سازمان بهداشت جهاني و براي اهداف درماني مناسب است. همچنين اين روش خالص‌سازي قابليت دارد تا محتواي ويروسي را تا حد قابل قبولي كاهش دهد. بنابراين، اختراع حاضر با بهبود فرايند توليد منجر به افزايش كيفيت، ايمني و بازدهي مي‌شود و هزينه‌هاي توليد را كاهش داده است، لذا مي‌تواند به طور قابل توجهي براي سيستم‌هاي بهداشتي جوامع در حال توسعه كمك كننده باشد.

BMP ها پروتئين هايي با خاصيت تحريك استخوان زايي هستند كه براي درمان شكستگي هاي حاد بكار مي روند. عليرغم مزاياي زياد، تجويز دوز بالايي از اين پروتئين هاي نوتركيب براي بدست آمدن نتايج كلينيكي مطلوب لازم است كه اين مسئله به نوبه خود باعث بروز عوارض جانبي و هزينه هاي سنگين درمان مي شود. استراتژيهاي متفاوتي براي توليد نسل دوم BMP ها با كارايي بيشتر و عوارض جانبي كمتر بكار برده شده اند، مثلا دستكاري ژنتيكي و تغيير ناحيه اتصال به هپارين، به منظور افزايش زمان ابقاء (local retention time) مورفوژن در محل اثر، يكي از اين روش ها محسوب مي شود. به منظور بهبود خواص BMP-7، موتانت جديدي از اين پروتئين با موفقيت در ميزبان يوكاريوتي (CHO) بيان گرديد. جايگزيني پايانه آميني BMP-7 با ناحيه اتصال به هپارين از BMP-2، به منظور افزايش ظرفيت اتصال به تركيبات ماتريكس خارج سلولي از جمله هپارين و هپاران سولفات صورت گرفت. موتانت جديد علاوه بر داشتن فعاليت بيولوژيكي، قابليت اتصال به هپارين بيشتري نسبت به نوع تجاري از خود نشان داد. به نظر مي رسد اين پروتئين با ناحيه اتصال به هپارين تقويت شده به عنوان اولين داروي نسل دوم مزيت هاي كلينيكي بيشتري نسبت به فرم تجاري موجود ارائه دهد .

در حال حاضر از پركاربردترين پروتئينهاي نوتركيب درماني موجود، آنتي بادي هاي منوكلونال (mAb) هستند. امروزه اكثر آنتي بادي ها در سلول هاي پستانداران به ويژه سلول هاي تخمدان هامستر چيني(CHO) توليد مي شوند. يكي از موانع براي توليد آنتي بادي ها در سلول هاي CHO، بيان پايين اين سلول ها مي باشد. نياز روز افزون به اين آنتي بادي هاي درماني، منجر به توسعه فرايندهاي توليد در مقياس بالا، بهبود ميزان توليد و بهينه سازي سيستم بيوراكتور شده است. قبل از كشت در بيوراكتور، مراحل اوليه توليد از اهميت خاصي برخوردار هستند كه از طريق دست ورزي اين مراحل مي توان به افزايش توليد دست يافت. از طريق مهندسي وكتور با افزايش فعاليت رونويسي، ميزان توليد آنتي بادي در محيط كشت سلول را مي توان افزايش داد. انتخاب يك پرموتور قوي مي تواند در افزايش بيان پروتئين هدف موثر باشد. پرموتور ژن فاكتور طويل سازي (EF-1α) در هامستر چيني ( (CHEF-1α به دليل سيستم بياني همولوگ، مي تواند كانديد مناسبي براي ساخت سلول پايدار باشد كه در اين مطالعه وكتورحاوي پرموتورCHEF-1α به منظور افزايش بيان آنتي بادي ساخته شد. چالش ديگري كه در رابطه با بيان آنتي بادي هاي هدف وجود دارد، بيان مناسب و متعادل از هر دو زنجيره آنتي بادي مي باشد. به صورت متداول بيان آنتي بادي در سلول هاي CHO از طريق ترانسفكت سلول ها با دو پلاسميد مختلف كه هر كدام يك زنجيره را بيان مي كنند، صورت مي گيرد. ترانسفكشن سلول با دو وكتور مستقل، مؤثرترين روش براي بيان متعادل هر دو رشته نيست. به طور عمومي پذيرفته شده است كه محل دخول سازه در ژنوم تأثير بسزايي در بيان ژن نوتركيب دارد. وجود دو زنجيره بر روي يك وكتور مي تواند منجر به بيان متعادل و متناظر هر دو زنجيره در سلول شود. با قرار دادن يك توالي اتصالي بين هر دو زنجيره آنتي بادي، مي توان بيان هر دو رشته را تحت كنترل يك پرموتور قرار داد. در اين مطالعه از توالي اوليگو پپتيدي 2A با منشاء ويروسي استفاده شده است. اين توالي طولي با ميانگين 18 تا 22 اسيد آمينه دارند. زنجيره هاي سبك و سنگين به طور همزمان از روي يك mRNA با يك Open Reading Frame (ORF) بيان مي شوند. در مرحله سنتز پروتئين، توالي پپتيدي 2A طي فرايند Ribosome Skipping سبب سنتز مجزاي هر يك از رشته ها مي شود. در اين اختراع، طراحي و ساخت وكتور حاوي پرموتورCHEF-1α و هر دو زنجيره آنتي بادي كه با توالي اوليگو پپتيدي 2A به يكديگر متصل شده اند، و همچنين استفاده از اين وكتور بياني براي بيان آنتي بادي هدف در رده سلولي CHOمورد بررسي قرار مي گيرد.

زمينه فني اختراع اين اختراع مربوط مي شود به خالص سازي با روش هاي منحصر به فرد پروتئين مورد نظر و فرمولاسيون و در نهايت، بررسي خصوصيات فارماكوكينتيكي مولكول جديد دارويي mt-PA در حيوان آزمايشگاهي Rat شرح مختصر در حال حاضر بيماري هاي قلبي – عروقي كه به وسيله اختلالات قلبي و عروق خوني ايجاد مي‌شود، ساليانه 3/17 ميليون مرگ و مير را به خود اختصاص ‌داده اند و آمارها بيانگر رشد بيشتر از 6/23 ميليون در سال 2030 مي‌باشند. تا به حال 3 داروي ترومبوليتيك مورد تاييد FDA قرار گرفته است كه هر كدام مشكلاتي مربوط به نيمه عمر كوتاه و ميل اتصالي پايين به ترومبين و تخليه فيبرينوژن گردش خون و ... دارد. با توجه به خصوصيات مطلوب مولكول جديد دارويي mt-PA از جمله، كاهش پاكسازي پلاسمايي، كاهش اندازه مولكول و افزايش نيمه عمر در جريان خون، افزايش اختصاصيت به فيبرين و مقاومت به مهار-كننده پلاسمينوژن بافتي (PAI-1)، در اين اختراع خالص سازي با استفاده از روش هاي افينيتي كروماتوگرافي با تركيب بافرهاي منحصر به فرد براي اين پروتئين و Size exclusion chromatography و نيز فرمولاسيون اين مولكول انجام شد و در نهايت، خصوصيات مطلوب فارماكوكينتيك آن در مقايسه با داروي مشابه موجود در بازار در حيوان آزمايشگاهي rat نشان داده شد.

اختراع حاضر روشي براي توليد IgG با خلوص بالا و كيفيت مناسب اهداف درماني از پلاسماي خون و ساير مشتقات خون، با بهبود بازدهي توليد است. در اين روش به منظور تخليص IgG (توليدIVIG )، چندين مرحله فيلتراسيون، نمك زدايي و كروماتوگرافي استفاده شده است. تركيب اين مراحل از اتلاف پروتئين IgG ، ميزان پروتئين مجتمع شده و دناتوره شده، مشابه آنچه در استفاده از اتانول سرد يا ساير رسوب دهنده ها در فرايند تخليص رخ ميدهد، كمتر شده است. ميزان خلوص محصول به دست آمده با اين روش در مقايسه با نمونه هاي موجود در بازار و با توجه به شرايط فارماكوپه، مناسب بوده و مقادير زير كلاسهاي مختلف آن (IgG1, IgG2 IgG3, IgG4) نرمال است و با داشتن دو مرحله غير فعال سازي و حذف ويروسي با استفاده از تركيب حلال-شوينده و نانوفيلتراسيون، ايمني و خلوص كافي جهت استفاده در موارد پزشكي و درماني را دارد. اين روش همچنين اين امكان را فراهم مي كند كه پروتئين هاي درماني ديگر موجود در پلاسما، مانند آلبومين بدون صدمه خوردن به طور مستقل خالص سازي شوند .

نظر به نقش حياتي عوامل ترميوبيتيك در درمان بيماران با انفاكتوس حاد قلبي، توسعه انواع عوامل ترميوبيتيك بسيار مورد توجه بوده است. امروز داروهاي فعال كننده پلاسمينوژن جديد با ويژگيهاي بهينه فرماكوكينتيك و فارماكوديناميك مدنظرند. فرم هاي متفاوت كوتاه شده ()Truncated) شامل دويمنهاي K2S با هدف كاهش حذف كبدي و افزايش نيمه عمر دارو مورد بررسي قرار گرفته اند ليكن با حدف دومين finger كه نقش اتصال به فيبرين را دارد تمايل دارو به فيبرين كاهش و نتيجتاً عارضه هموراژي آن افزايش مي يابد. در اين مطالعه به جهت جبران اين نقص دارو يك قطعه 4 آمينو اسيدي (GHRP) با تمايل مناسب به فيبرين در بالادست دومينهاي K2S قرار گرفته كه منجر به بهسازي تمايل به فيبرين و كاهش عوارض جانبي دارو مي گردد. همچنين يك قطعه 4 آمينو اسيدي واقع در توالي KHRR 296-299 با چهار آمينو اسيد آلانين جايگزين گرديده كه اين عمل در افزايش مقاومت به مهاركننده دارو و افزايش نيمه عمر آن مؤثر است.

گياهان به عنوان يك جايگزين اميدبخش براي تخمير ميكروبي و كشت سلول هاي جانوري جهت توليد پروتئين هاي نوتركيب پيشنهاد شده اند، براي اينكه مزايايي همچون ايمني بالا، هزينه پايين، تغييرات پس از ترجمه حجم بالاي توليد دارند. قيمت تمام شده توليد پروتئين هاي نوتركيب در گياه در مقايسه با سيستم هاي ديگر در حدود يك دهم تا يك صدم است. tPA، فعال كننده اصلي پلاسمينوژن در خون مي باشد در صورتي كه نقش اصلي uPA پروتئوليز وابسته به بافت است و عقيده بر اين است كه نقش آن در حذدف فيبرين داخل عروقي نسبت به tPA، ثانويه مي باشد. فيبرينوليز عمدتا در سطح فيبرين آغاز و منتشر مي شود زيرا اين سطح محل هاي اتصال براي تماس بهينه بين تعدادي از اجزاي سيستم فبرينوليتيك به خصوص پلاسمينوژن و tPA را مهيا مي كند. اين اثر تحريكي، غلظت بالايي از پلاسمينوژن و tPA را در رسوبات فيبرين به وجود مي آورد و موجب متمركز شدن فعاليت پلاسمين در اين ناحيه مي گردد. در اين پژوهش ژن tPA پس از جداسازي در ناقل بياني گياهي مناسب (pBI121) كلون گرديد. ژن مورد نظر با استفاده از آگروباكتريوم به گياهان توتون منتقل گرديد. گياهان تراريخت در محيط كشت انتخابي حاوي آنتي بيوتيك هاي كانامايسين (100mg/l) و سفاتاكسيم (200mg/l) باززايي شدند. آناليز ملكولي PCR بر روي DNA ژنومي استخراج شده از گياهان باززايي شده با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي، انتقال ژن tPA را به گياهان باززايي شده تأييد كرد. توليد پروتئين نوتركيب فعال tPA با استفاده از آناليزهاي SDS-PAGE و زيموگرافي اثبات گرديد. بعد از باززايي كلا 45 گياه با منشأ متفاوت به دست آمد كه از اين تعداد 21 گياه نرمال بودند. اين گياهان ايزوله گرديدند و به زور جمع آوري شده از گياهان تراريخت در محيط كشت MS حاوي آنتي بيوتيك كانامايسين (با غلظت 50mg/lit) كشت گرديدند و جهت تهيه گياهان نسل T1 مورد استفاده قرار گرفتند. آزمايشات مولكولي و بيوشيميايي توليد پروتئين نوتركيب فعال tPA را در گياهان باززايي شده در نسل T1 تأييد كرد. با استفاده از نرم افزار Photocapt و محاسبه سطح زير منحني مربوط به باند اضافي مربوط به SDS-PAGE در گياهان تراريخت ميزان tPA در كل پروتيين قابل حل، محاسبه گرديد. نتايج نشان داد كه ميزان بيان پروتئين نوتركيب از 1/012٪ تا 1/26٪ در كل پروتئين قابل حل متغير است. اين اولين گزارش از توليد پروتئين نوتركيب و همچنين اولين گزارش توليد tPA در گياه در دنيا مي باشد.